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Projekt

Transformation-induzierte Mutationen


Federführendes Institut FG Institut für Forstgenetik

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Transformation-induzierte Mutationen in biotechnologisch erzeugten Bäumen

Gentechnisch übertragene DNA Sequenzen sowie Methoden der Genommodifizierung (CRISPR/Cas) können als mögliche Ursachen für genomische Instabilitäten in Betracht gezogen werden.

Hintergrund und Zielsetzung

In dem Forschungsvorhaben sollen potentielle Biosicherheitsrisiken evaluiert werden, die aus Interaktionen insbesondere zwischen den zu übertragenden Gensequenzen (Promotor, Gen, Terminator, cis- und trans-Elemente, etc.) und Bereichen des Genoms der Pappel untersucht werden. Beispielsweise kann der 35S-Promotor des Blumenkohlmosaik-Virus, der für die Regulation von gentechnisch übertragenen Genen am häufigsten eingesetzte Promotor (sowie anderen aus Viren stammenden Sequenzen) , mit im Pappelgenom "schlafenden" endogenen Viren, als auch vorhandenen Retroelementen interagieren. Diese Interaktionen könnten sowohl die üblicherweise „schlafenden“ Retroelemente/endogene Transposons sowie Viren aktivieren, was zu erhöhten, biosicherheitsrelevanten genomischen Instabilitäten führen kann, als auch durch Rekombination völlig neuartige Retroelementen/Transposons bzw. Viren entstehen lassen. Auch die Integration der neu übertragenden Genen im Pappelgenom kann zu Inaktivierung oder Hyperaktivierung endogener Gene führen.

Zudem soll das vollständige Erbgut von Pappeln, bei denen einzelne Gene mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems modifiziert wurden, sequenziert und nach möglich "off-target" Mutationen hin untersucht werden. Auch sind mögliche sekundäre Effekte der durch Genomeditierung mutierten Gene denkbar.

Vorgehensweise

In initiierenden Experimenten sind zunächst Hilfe der AFLP-Technik bereits existierende transgene Pappellinien hinsichtlich der genomischen Stabilität untersucht worden. Es konnten keine genomischen Instabilitäten festgestellt werden, weder die Aktivierung von "schlafenden" Retroelementen/Transposons noch von endogenen Viren. Inzwischen werden die Sequenziermethoden der nächsten Generation angewendet, um auch Methoden der Genommodifizierung (CRISPR/Cas) als mögliche Ursache für genomische Instabilitäten zu überprüfen. Auch sonst konnten in allen bisher erhaltenen Ergebnissen keine Hinweise auf signifikant erhöhte genomische Instabilitäten als Folge der biotechnologischen Methoden im vergleich zur konventionellen Mutagenese gefunden werden.

Die Methoden der Genomeditierung (CRISPR/Cas9, und andere) arbeiten so präzise, dass (bisher) nur Modifikationen an den "gewünschten" Genen festgestellt werden konnten. Hinweise für "off-target"-Effekte gab es (bisher) noch nicht. Allerdings laufen auch Untersuchungen zu Nickase-Modifikationen, bei denen kein kompletter Doppelstrangbruch zu beobachten ist, sondern nur ein Einzelstrangschnitt, um gezielt bestimmte Genabschnitte austauschen zu können. Hierzu liegen noch keine Ergebnisse vor.

Vorläufige Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, dass wie erwartet zwischen den verschiedenen transgenen Linien und der nicht-transgenen Kontrolle eine hohe genomische Stabilität existiert. Vereinzelt jedoch sind reproduzierbare Abweichungen des AFLP-Musters gefunden worden, die auf eine Transformation-induzierte genomische Mutation hinweist. Weitere Untersuchungen sollen die Ursachen für die beobachteten Variationen aufklären.

Publikationen zum Projekt

  1. 0

    Fladung M (2016) Cibus' herbicide-resistant canola in European limbo. Nature Biotechnol 34(5):473-474

  2. 1

    Fladung M (2014) Prospects of using a modified Ac/Ds transposon system from maize for activation tagging in the tree species Populus. In: Ramawat KG, Mérillon J-M, Ahuja MR (eds) Tree biotechnology. Boca Raton: CRC Press ; Taylor & Francis, pp 469-482

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