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Hintergrund und Zielsetzung

Das Projekt beinhaltet drei vornehmliche Ziele:

1. Modellhaft soll an der Pappel geklärt werden, welche Genvarianten – alleine oder in Kombination – wichtig sind, Bäume für die Herausforderungen der Klimawandels (Trockenstress) widerstandsfähig zu machen.
2. Für die Pappel soll ein genetisches Markerset zur Identifizierung von Individuen mit einer Prädisposition für Klimawandeladaption getestet werden. Diese Individuen könnten anschließend gezielt für die genetisch fundierte Plusbaum-Auswahl zur Züchtung verwendet werden.
3. Die Erkenntnisse aus der Modellbaumart Pappel sollen auf die aktuell stark geschädigte Rotbuche Fagus sylvatica übertragen werden. Hierfür sollen zum einen die Genomeditierung bei der Buche getestet und zum anderen anhand von editierten Buchen die Auswirkung natürlicher genetischer Variation auf die Trockenheitstoleranz ermittelt werden.

Die gewonnenen Erkenntnisse könnten ggf. auch auf andere Baumarten übertragen werden. Die FNR-Nachwuchsgruppe „Genetische Technologien“ zielt daher darauf ab, Bäume für den Klimawandel vorzubereiten und so ihren Fortbestand in Deutschland zu sichern.

Vorgehensweise

Etablierung der Buche für sterile Gewebekultur und Genomeditierung

Für Buchen soll eine in vitro-Kultur etabliert werden, die in Deutschland einzigartig wäre, obwohl die Buche hierzulande eine bedeutende Baumart ist. Dazu soll das bestehende Know-How der Gewebekultur von Pappeln, Ulmen, Eschen und Birken auf die Rotbuche übertragen werden, damit wir bis zu 10 unterschiedliche Buchen-Genotypen für eine Überführung in die sterile Gewebekultur testen können. Für die Buche werden alle Kultivierungsbedingungen wie Kulturmedium inkl. aller Zusätze, Temperatur, Beleuchtungsintensität, Luftfeuchtigkeit angepasst und optimiert. Nach erfolgreicher Etablierung soll – bislang weltweit einzigartig – die Genomeditierung bei der Buche getestet werden.

Ziel des Projekts ist es ausdrücklich nicht, genomeditierte Bäume in Forst- oder Waldgebiete zu pflanzen. Die Genomeditierung dient uns als laborgestützte Methode in einem überschaubaren Zeit- und Kostenrahmen Bäume mit veränderten genetischen Merkmalen zu produzieren und das Potential der ausgewählten Gene zur Standortanpassung zu ermitteln. Die einmal gefundenen und getesteten Genvarianten sollen dann über konventionelle Züchtung (Kreuzung und Selektion) in der Zuchtpopulation angereichert werden.

Genetische Analysen im Modellsystem Pappel

Da die Rotbuche eine eher langsam wachsende Baumart ist, sollen zeitlich parallel genetische Analysen anhand der Modellbaumart Pappel durchgeführt werden. Für sechs ausgewählte Kandidatengene wird die innerartliche Variation in kodierenden und regulativen Bereichen der Gene detektiert. Ziel ist es, die Auswirkung der Variation in diesen Kandidatengenen auf die Trockenstresstoleranz der Pappeln zu ermitteln.

Als Kandidatengene eignen sich die Gene SCL4 und SCL7 (Bruegmann 2016; Fromme 2017), die bereits am Thünen-Institut für Forstgenetik anfänglich bearbeitet wurden. In Zhang et al. (2019) wurden weitere GRAS-Transkriptionsfaktoren in der Orange Citrus sinensis untersucht, die für die Bearbeitung in diesem Projekt geeignet sind. Weizen wurde als etablierte Nutzpflanze bereits auf das Merkmal erhöhter Trockenstresstoleranz gezüchtet. Aus den vorhandenen Analysen (z.B. Fleury et al. 2010) soll ein weiteres Kandidatengen identifiziert und bearbeitet werden. Die bestehenden Erkenntnisse zu diesen Kandidatengenen sind im folgenden Abschnitt II.1 und II.2 näher beschrieben.

Durch Genomeditierung mittels CRISPR/Cas werden einzelne Variationen verändert, so dass Rückschlüsse auf die Funktion der einzelnen Genbereiche gezogen werden können. Die Genomeditierungen sollen durch DNA-Sequenzierung auf genetischer Ebene nachgewiesen werden, zudem auf Proteinebene um resultierende funktionelle Änderungen der Gensequenz nachzuweisen. Insbesondere die Proteinfaltung könnte auf die ausgewählten Transkriptionsfaktoren unter den Kandidatengene eine Auswirkung haben, wenn die DNA-Bindedomänen verändert werden.

Testen der Genomeditierung für die Buche

Die CRISPR/Cas-basierende Genomeditierung soll bei der Buche getestet werden. Dazu soll zunächst die sterile Gewebekultur für die Buche adaptiert und mindestens zehn Genotypen versuchsweise in die Gewebekultur überführt werden. Für die Buche wird nachfolgend ein Regenerations- und Transformationssystem erstellt sowie die am besten geeignete Nuklease zur Editierung ermittelt. Nach Erstellen der gRNA und Donor-Sequenzen werden Genomeditierungen durchgeführt, um, wie zuvor für die Pappel beschrieben, die genetische Variabilität zu verändern und nachfolgend die funktionelle Auswirkung der intraspezifischen Variabilität zu ermitteln.

Stressversuche

Mit den genomeditierten Pappeln sollen im Gärtnereibetrieb innerhalb speziell ausgerüsteter Gewächshause Trockenstressversuche durchgeführt werden, sodass ermittelt werden kann, welche Editierungen Einfluss auf die Trockenstresstoleranz der Pappel haben. Daraus soll die Abhängigkeit der Trockenstresstoleranz von bestimmten variablen Bereichen in den Kandidatengenen abgeleitet werden. Erwartet werden signifikante, phänotypische Veränderungen. Während des Stressversuchs wird die Stressintensität über phänotypische Bonitur und physiologische Messungen (z.B. Photosyntheseleistung) ermittelt. Ferner soll die Expression stresskorrelierender Gene analysiert werden.

Die beschriebenen Stressversuche und nachfolgenden Analysen sollen ebenfalls nach der Methodenentwicklung mit den erzeugten genomeditierten Buchen durchgeführt werden.

Transkriptomanalyse

Es ist beabsichtigt, eine Expressionsanalyse (RNA-Sequenzierung) mit verschiedenen Rotbuchenherkünften durchzuführen, die in Berlin in einem deutschlandweit einzigartigen Modellversuch angepflanzt sind. Hier sollen verschiedene Herkünfte gezielt unter Trockenstress gesetzt werden. Anhand der Ergebnisse kann geklärt werden, welche natürliche Reaktion (Welche Gene werden ein- bzw. ausgeschaltet?) die Rotbuchen unter Trockenstress zeigen, wie schnell sie auf den Stress reagieren (Wie schnell und wie stark wird die Genexpression reguliert?) und ob die standortabhängige, unterschiedliche Stresstoleranz, z.B. zwischen norddeutschen und süditalienischen Rotbuchen, mit einer unterschiedlichen Genregulation zusammenhängt. Als Partner sind Arbeitsgruppen der Freien Universität Berlin und der Technischen Universität Braunschweig vorgesehen.

Akademische Aus- und Weiterbildung

Wie im Förderaufruf beschrieben, nehmen wir unsere Verantwortung in der akademischen Aus- und Weiterbildung wahr, indem der Nachwuchsgruppenleiter die Habilitation sowie zwei Doktoranden die Promotion erreichen sollen. Auch in der universitären Lehre soll der Nachwuchsgruppenleiter eingebunden werden. Innerhalb abgesteckter Projektteile können Studierende ihre Abschlussarbeiten absolvieren.